كيمياء

الدورة العملية 6: اختبار LacZ

الدورة العملية 6: اختبار LacZ


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إجراء التجربة: لاكاختبار Z

زراعة الثقافات الاختبارية واضطراب الخلية

لهذه التجربة ، يتم توفير لوحات أجار مع مستعمرات مفردة ، كل منها يحتوي على بلازميد يعتمد على المتجه pOM8 مع جزء مروج مختلف. مرتين (تحكم!) 2 مل وسط سائل في أنبوب اختبار معقم معقم مع مستعمرة واحدة و بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية المحتضنة في الأسطوانة.

في صباح اليوم التالي سيكون 0.5 مل الثقافة بين عشية وضحاها إزالتها و 5 مل متوسطة في التحضير 50 مل- قوارير معينة. بعد 2 ح اهتز في 37 درجة مئوية هو كثافة بصرية OD600 تم الوصول إلى حوالي 1. الثقافة بأكملها الآن في درجة جليدية 12 مل نقل أنابيب البولي كربونات لمدة 15 دقيقة مبرد بالثلج ولمدة 10 دقيقة بالطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة في أجهزة الطرد المركزي المبردة SORVALL.

يتم صب المادة الطافية. لإزالة المادة الطافية تمامًا ، تظل الأنابيب مقلوبة على ورق ماص لبضع دقائق. الحبيبات هي 5 مل تمت إضافة Z-buffer وتعليقه على الدوامة.

1 مل يستخدم هذا التعليق لتحديد OD600 ماصة في كفيت بلاستيكي وتخزينها في مقياس الضوء حتى القياس لاحقًا (لا تنس المعيار المتوسط) مل يتم تبريد المعلق على الجليد وتتعطل الخلايا عن طريق العلاج بالموجات فوق الصوتية (40 س/150 دبليو.؛ استخدم حماية السمع!).

اختبار الانزيم

100 مايكرولتر من المحللة (صوتنة) توضع في الثانية مل- أنبوب إبندورف ينقل ويخفف بـ 900 ميكرولتر Z-buffer. بدأ تفاعل الإنزيم الآن بإضافة 200 ميكرولتر ONPG. من أجل تحقيق وقت رد فعل مشابه ، يجب تنفيذ خطوات الماصات هذه بشكل متساوٍ قدر الإمكان (على سبيل المثال ، بدء التفاعل في فواصل زمنية مدتها 30 ثانية). بعد كل خطوة لسحب العينة ، يتم خلط الخليط الموجود على النص الأولي.

بعد 3 دقيقة يتم إيقاف تفاعل الإنزيم بإضافة 500 ميكرولتر من كربونات الصوديوم. من المهم أن تتم إضافة كربونات الصوديوم بنفس الترتيب وفي نفس الفاصل الزمني مثل ONPG من قبل ، من أجل الحفاظ على أوقات التفاعل متطابقة قدر الإمكان لجميع العينات. لكن كن حذرًا: إذا لوحظ تلون أصفر شديد في إحدى العينات قبل انقضاء وقت رد الفعل البالغ ثلاث دقائق ، فيجب تكرار التجربة بأكملها بتخفيف أعلى.

بعد اختبار الإنزيم ، يتم استخدام أوعية التفاعل لمدة 10 دقيقة بالطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي المبردة بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لتجنب أخطاء القياس بسبب بقايا الخلايا المتبقية. يتم وضع حوالي 1 مل من المادة الطافية في كفيت بلاستيكي معنون و OD420 مصممة مقابل معيار مناسب.

مستخدم بكتريا قولونيةسلالات مع البلازميدات

التقييم

يتم التقييم وفق الصيغة التالية:

نشاط [u] = التطوير التنظيمي420 × 1،000 × طندقيقة-1 س حجم الاختبار -1 × التطوير التنظيمي600-1

ردقيقة= وقت رد الفعل بالدقائق

يتعلق حجم الاختبار بتخفيف خليط التفاعل ؛ على سبيل المثال ، التخفيف بعشرة أضعاف يتوافق مع القيمة 0.1.


فيديو: Gene Regulation: The Lac Operon. A-level Biology. OCR, AQA, Edexcel (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Elmoor

    شيء قيم جدا

  2. Reyhurn

    لقد فكرت وأزلت الرسالة

  3. Fenrile

    موضوع تقرأ؟

  4. Brat

    أعتقد أنك ترتكب خطأ. دعونا نناقشها. اكتب لي في رئيس الوزراء ، وسوف نتواصل.

  5. Waescburne

    أنا أعتبر، أنك لست على حق. أنا متأكد. يمكنني إثبات ذلك. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.

  6. Phrixus

    شكرا جزيلا على مساعدتك في هذا الأمر. لم اكن اعرف ذلك.



اكتب رسالة